由于亚细胞区室，哺乳动物细胞本质上是复杂的，因此使得分子生物学实验室中核酸的稳健转录靶向过程有些挑战。在最近发表在《自然生物技术》上的一份报告中，David Colognori和由诺贝尔化学奖获得者Jennifer Doudna领导的研究小组在9年与Emmanuel Charpentier一起发现并扩展了CRISPR-Cas2020技术，在这项研究中将一种新的复合物纳入了CRISPR复合物。
该团队使用了成簇规则合并的短回文重复序列(CRISPR)-Csm复合物;其中包括一种称为Csm的蛋白质，这是一种在原核免疫系统中发现的III-A CRISPR-Cas干扰复合物。此后，分子生物学家通过单载体递送完成了核和细胞质转录本的手术RNA消融(删除)。载体结合的嗜热阶梯球菌Csm复合物提供了高效的RNA敲低;一种沉默基因表达的方法，对人类细胞的脱靶影响最小，并且优于现有的基因组编辑技术，如短发夹RNA和Cas13介导的敲低。通过催化灭活Csm，该团队实现了活细胞RNA成像的持久RNA结合，以确定CRISPR-Cas效应器系统作为真核生物中RNA靶向工具的效率。
基因编辑：从RNA干扰方法到CRISPR-Cas复合物
分子生物学家试图在不永久影响DNA的情况下改变RNA和蛋白质水平;然而，这项任务在基础研究和治疗应用中并非易事。过去，科学家们通过使用RNA干扰或RNAi在真核生物中开发了靶向RNA敲低技术，其中小的干扰RNA定向的argonaute核酸酶(RNA诱导的沉默复合物的活性部分)切割互补的靶RNA。然而，这种方法导致携带部分相似或互补序列的靶标意外切割，特别是当互补性发生在siRNA的成核“种子”区域时，同时与真核模型系统不相容。
同时，现在广泛流行的簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-Cas)形成针对原核生物感染因子的适应性防御系统，可以作为DNA或RNA核酸酶发挥作用，可以调节基因编辑应用。与小干扰RNA非常相似，Cas核酸酶由小RNA组成，通过互补碱基配对识别核酸靶标。在这项工作中，Colognori及其同事使用Csm蛋白作为RNA敲低或基因沉默的有吸引力的工具。该蛋白仅在原核生物中发现，可以在不使用交叉宿主调节途径的情况下引入真核生物，从而使研究小组能够证明Csm系统是真核生物中的多功能RNA敲低方法。
一体化III型CRISPR-Cas系统
科学家们根据一些特征选择了嗜热链球菌的III-A Csm复合物，例如其在细菌中现有的生化和结构特征，最佳功能以及在斑马鱼胚胎和其他真核细胞(包括人类细胞培养物)中进行的先前工作。该团队验证了永生化人胚胎肾细胞中单个蛋白质组分的表达，并通过将所有组分整合到单个载体中来简化Csm系统的递送。他们使用Csm敲低高度过表达和异源的转基因，并在蛋白质水平上研究敲低。
在研究期间，研究小组用多合一载体转染肾细胞，以对所有感兴趣的RNA实现90%以上的敲低。结果强调了Csm作为一种有效的RNA敲低工具的高度稳健性。研究人员通过执行RNA荧光原位杂交(FISH)来可视化特征形态，从而验证了结果。这项工作显示了活性Csm复合物如何通过分子和微生物学相关方法产生类似的稳健敲低。
以最小的脱靶和细胞毒性观察RNA敲低活性
为了评估Csm介导的敲低在细胞中的潜在脱靶效应，研究小组接下来进行了RNA测序。他们将复合体的效率与现有方法进行了比较，并进行了48小时的敲低。然后，研究小组用转染的细胞完成了荧光激活的细胞分选和测序方法。
结果表明，Csm表达不会干扰细胞环境。研究人员在不影响RNA酶活性的情况下去除了DNA酶活性，以最小的Csm介导的RNA敲低在人类细胞中的脱靶效应。与严重细胞毒性的Cas13 RNA靶向CRISPR-Cas系统相比，III型系统没有显示出强壮RNA敲低的反式切割活性，并且没有毒性。
无需基因操作的活细胞 RNA 成像
接下来，研究小组试图了解追踪细胞中RNA的过程。虽然在活细胞中追踪RNA的过程并非易事，但分子生物学家以前已经用RNA结合蛋白(如催化无活性的Cas13)完成了这项任务。研究人员探索了使用Csm复合物通过将绿色荧光蛋白(GFP)融合到催化无活性的Csm蛋白来跟踪活细胞中RNA靶标的可能性。接下来，他们用Csm-GFP质粒转染肾细胞系，并在48小时后测定活细胞荧光显微镜，以证明该蛋白质可以很容易地可视化活细胞中的RNA。
展望
通过这种方式，Doudna实验室的David Colognori及其同事展示了整合源自原核生物嗜热链球菌的III-A型Csm复合物的可能性，作为完成真核RNA敲低和基因沉默的有力工具。与现有方法相比，该团队以高效率和特异性进行了RNA敲低实验，并优于现有竞争对手。最值得注意的是，与其他基于Cas13的方法不同，该过程没有伴随可检测到的细胞毒性。
研究人员促进了多组分CRISPR-Cas系统在单个可递送质粒中的有效转染。以这种方式首次有效地将III型系统带入真核生物的能力对RNA诊断，健康筛查和体内合成生物学回路具有重大意义。